Quantitative Analysis of RNA

Quantitative Analysis of RNA Aim:  To determine the amount and concentration of RNA sample isolated  from bacterial cells Ligation of DNA fragments Principle:  This experiment is purely an application of the Beer Lamberts’ Law which states that the concentration of the sample is directly proportional to the absorbance of light done by the sample. It is given by the following expression A = E*C*l The device UV spectrophotometer works on this principle and used to find  the concentration of the sample Materials Required : RNA sample TE buffer UV spectrophotometer PROCEDURE: Remove a 10 µl aliquot of total RNA and dilute with 990 µl of TE buffer (10  mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.0). Restriction Enzyme Digestion Read at A260 and A280 blanked against TE buffer and calculate the amount of RNA obtained. The RNA obtained may be determined by the formula Total RNA (ug) = (A 260) (40 ug) (100) (0.05 ml)  A260 is the absorbance of the solution at 260 nm …

Quantitative Analysis of RNA Read More »

Restriction Enzyme Digestion

Restriction Enzyme Digestion Aim: To digest the pUC18 DNA with BamH1 enzyme Principle:  Restriction endonucleases are the class of enzymes that are used to cleave DNA at specific sites called Restriction sites. Every restriction enzyme has a specific restriction site at which it cuts a DNA molecule. For example restriction sequence for BamHI is GGATCC  (type  II restriction enzyme.  The most abundantly used restriction enzymes are type II restriction enzymes which  cleave at specific restriction site only.  These endonucleases function adequately at pH 7.4 but different enzymes vary in their requirements for ionic strength usually provided by sodium chloride and magnesium chloride. It is also advisable to add a reducing agent such as dithiothreitol (DTT) which stabilizes the enzymes and …

Restriction Enzyme Digestion Read More »

Quantitative Analysis of DNA

Quantitative Analysis of DNA Aim: To determine the amount, concentration and purity of the given DNA sample Principle: This experiment is purely an application of the Beer Lamberts’ Law which states that the concentration of the sample is directly proportional to the absorbance of light done by the sample. It is given by the following expression A=E*C*l The device UV spectrophotometer works on this principle and used to find the concentration of the sample. Concentration and quality of a sample of DNA are measured with a UV  spectrophotometer. A standard graph can be drawn using different concentrations of DNA and OD (optical density) values. The diagram above shows that a beam of monochromatic radiation (Io) is directed to a  sample solution. Absorption takes place by the sample and the beam of radiation is  leaving out (I) Materials Required: DNA sample TE buffer UV spectrophotometer PROCEDURE: Take …

Quantitative Analysis of DNA Read More »

Scroll to Top